【{‘担保 信息’}】分子杂交

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[拼音]:fenzi zajiao

[英文]:molecular hybridization

不同来源的核酸单链之间或蛋白质亚基之间由于结构互补而发生的非共价键的结合。根据这一原理发展起来的各种技术统称为分子杂交技术,核酸分子杂交技术是分子遗传学中的重要研究方法。

核酸分子杂交

具有互补的碱基顺序的单链核酸分子,可以通过碱基对之间非共价键(主要是氢键)的形成即能出现稳定的双链区,这是核酸分子杂交的基础。杂种分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补,所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序(即某种程度的同源性)就可以形成杂种双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。由于DNA一般都以双链形式存在,因此在进行分子杂交时,应先将双链DNA分子解聚成为单链,这一过程称为变性,一般通过加热或提高pH值来实现。使单链聚合为双链的过程称为退火或复性。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素标记成为探针,再与另一种核酸单链进行分子杂交。由于同位素被检出的灵敏度高,所以在两种核酸分子之间即使只有百万分之一的同源顺序也可以被检出。

核酸分子杂交按杂交中单链核酸所处的状态可分为液相、固相和原位 3类。前二类方法都要求预先从细胞中分离并纯化杂交用的核酸。

在液相分子杂交中,两种来源的核酸分子都处于溶液中,可以自由运动,其中有一种常是用同位素标记的。从复性动力学资料的分析可探知真核生物基因组结构的大致情况,如各类重复顺序的含量及分布情况等。在固相分子杂交中,一种核酸分子被固定在不溶性的介质上,另一种核酸分子则处在溶液中,两种介质中的核酸分子可以自由接触。常用的介质有硝酸纤维素滤膜、羟基磷灰石柱、琼脂和聚丙烯醯胺凝胶等。早期用琼脂作为固定介质的分子杂交方法曾被用来测定从细菌到人多种生物的DNA的同源程度(见分子进化)。

1975年由E.萨瑟恩首创的萨瑟恩吸印法是一种方便易行的固相杂交方法。先将待测的 DNA用限制性内切酶切成片段,然后通过凝胶电泳把大小不同的片段分开,再把这些DNA片段吸印到硝酸纤维膜上,并使吸附在滤膜上的 DNA分子变性,然后和预先制备的DNA或RNA探针进行分子杂交,最后通过放射自显影就可以鑑别待测的哪个DNA 片段和探针具有同源顺序。精确控制杂交及洗涤条件(如温度及盐浓度),在同源顺序中即使有一对碱基错配也可检出。这技术已应用于遗传病(基因病)的临床诊断。另一种相似的方法是将待测的 RNA片段吸印在重氮苄氧甲基(DBM)纤维素膜或滤纸上,然后和预先制备的DNA探针进行分子杂交,这种方法称为诺森吸印法。这些技术大大地推进了分子遗传学研究和重组DNA技术的应用。

原位(分子)杂交实际上是固相杂交的另一种形式,杂交中的一种DNA处在未经抽提的染色体上,并在原来位置上被变性成单链,再和探针进行分子杂交。在原位杂交中所使用的探针必须用比活性高的同位素标记。杂交的结果可用放射自显影来显示,出现银粒的地方就是与探针互补的顺序所在的位置。

在基因定位的工作中,对固定在细胞学制片上的染色体DNA进行原位杂交,可以将与探针互补的顺序精确地定位到染色体的一定位置上(见图)。

在基因定位工作中,还可以应用一种在电镜下直接观察杂种分子的原位杂交方法,即所谓的R-环法。R-环是在双链DNA分子部分变性的情况下,单链的RNA分子和相应的DNA序列中的一条互补的单链形成RNA-DNA的杂合双链,同时DNA的另一条单链向外突出而形成的环状图象。由于每种mRNA由特定的基因所转录,和这一基因的一个DNA单链具有互补结构,因此通过观察标记mRNA参与构成的R环的位置就可以对产生这种mRNA的基因进行定位,这一方法还可以用来研究断裂基因的结构。

在重组DNA技术中,有些专门的原位杂交方法可以用来筛选有探针顺序的重组质粒或噬菌体(见基因文库)。

此外,分子杂交方法还可以用来分离具有特定顺序的核酸分子。例如使探针与细胞的总 DNA进行分子杂交,利用羟基磷灰石柱只吸附双链分子的特性,可以分离与探针互补的DNA片段或RNA分子。

蛋白质分子杂交

来自不同的蛋白质的亚基间也可以形成非共价键的结合,这是蛋白质分子杂交的基础。蛋白质分子杂交技术可以用来研究蛋白质的结构和功能以及相似的蛋白质(如同工酶、血红蛋白等)的亲缘关系。例如通过人、狗、兔、驴、小鼠和蛙等动物的血红蛋白的蛋白质分子杂交测验,根据能否形成杂种分子和杂种分子的量,可以判断它们的蛋白质分子的相似程度。

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